مناقشة رسالة طالبة الماجستير دينا داود سلمان من قسم علوم الحياة

ناقش قسم علوم الحياة في كلية العلوم بجامعة ديالى رسالة طالبة الماجستير دينا داود سلمان الموسومة دراسة بايولوجية وجزيئية لبكتريا Acietobacter baumannii المعزولة من مصادر مختلفة في مستشفيات مدينة بعقوبة وذلك في يوم الاثنين الموافق 2021/8/16 وعلى قاعة المناقشات في الملتقى الأكاديمي بالجامعة.

أوضحت الطالبة في دراستها أن بكتريا الراكدة البومانيةA.baumannii هي بكتريا سالبة لصبغة كرام انتهازية مرتبطة بالعدوى المكتسبة من المستشفيات‘ من غير شك اتها مقاومة للمضادات المايكروبية وكذلك لها القدرة على تكوين الغشاء الحيوي من قبل العزلات الطبية التي تمتلك النظم التي تمكنها من البقاء في بيئات المستشفى وتستعمر الادوات الطبية .

خلال فترة زمنية من شهر أيلول2020ولغاية شهر اذار 2021 ،تم جمع 220 عينة من مصادر مختلفة (الدم، ،الحروق ،الجروح ،الادرار ،القشع، الصديد، كذلك السوائل )ونتيجة لهذا العمل تم الحصول على 22عزلة للراكدة البومانيةA.baumannii بنسبة 10%من 220 عينة طبية 138اعطت نتيجة زراعة موجبة بنسبة 62.7%و 82عينة أعطت نتيجة زراعة سالبة بنسبة 37.3%.تم التشخيص لل138حيث كانت النتيجة البكتريا الموجبة لصبغة كرام بنسبة 25.54%و البكتريا السالبة لصبغة كرام بنسبة 37.27% من المجموع الكلي للعينات الطبية.

التشخيص الاولي للراكدة البومانية A.baumannii تم من خلال الماكونكي اكار بالاعتماد على خصائص الزراعة و الفحوصات البايوكيميائية كذلك من خلال نظام VITEK 2 Compact System GNوتم اجراء التشخيص الجزيئي جينات blaOXA51 و blaOXA 23 وفقا لفحص تفاعل البوليميراز المتسلسل PCR كانت نسب النتائج الموجبة على التوالي (100%،81%)من المجموع الكلي لعزلات الراكدة البومانية A.baumannii.

كما ان المصادر ذات التشخيص الموجب للراكدة البومانية A.baumanniiلل22كانت الحروق11(50%)،الجروح3(13.6%)الادرار 2(9%)السائل الدماغي الشوكي 1(4.5%). تم أجراء فحص الحساسية بطريقة انتشار القرص (Kerby Bauer Method)ضد12مضاد حيوي حيث ابدت العزلات مقاومة عالية (100%)ضد المضادات الحيوية (Amikacin, Ciproflaxacine and Levoflaxacin)بينما المقاومة ضد((Ampicillin sulbactam ,Cefetraxon , Doxycylin , Imepenem , Meronem , Trimetheprim Sulfomethazol and ceftazidum) كان على التوالي،)95%،81%،90%،40%،86%،90%،77%و81%)كما اظهرت جميع العزلات مقاومة مقدارها صفر (0%)لكل من colistin وpoly myxin B.

فئات عزلات الراكدة البومانية وفقا لفحص الحساسية كانت MDR(27.3%)،XDR(72.7%)وPDR(0%).

التركيز المثبط الادنىMIC عمل لجميع العزلات بأستخدام ثلاث مضادات هي(Ceftazidum م levofloxacine وColistin) بأستخدام الطريقة المعيارية بواسطة لوحة العيار الدقيقة وكانت قيمة الMIC لمضاد Levofloxacin )64≤4) ولمضاد Ceftazidum(1024≤16) وColistin(اثناء تجربة التعبير الجيني) كان MIC Sub-للعزلة الخامسة( 16 ) والعاشرة(8).

تم الكشف عن انزيم البيتا لاكتام-Lactamaseβ في ثلاث اصناف هي(MBLs ،ESBLs وAmpCالكشف عن الميتالو بيتا لا كتميز بالطريقة المظهرية تم بواسطة فحص(CEDT)وكان تواجد MBLs موجبا لعزلات الراكدة البومانية بنسبة 86% بواقع 19من 22عزلة وهذه النتيجة مشابهه لفحص الحساسية من 22عزلة كان هناك19 عزلة مقاومة للImipenem ولكن العزلات الخامسة والخامسة عشر واخيرا الاحدى والعشرون ،اظهرت حساسية لنفس المضاد واعطت نتائج سالبة للMBLs كما ان الكشف الجزيئي لهذا الانزيم تم من خال الكشف عن جين blaIMP وعن جين bla NDM-1 وكانت النتيجة لجميع العزلات سالبة .

اما الكشف عن ESBLs تم بطريقة DDST حيث اظهرت جميع العزلات مقاومة عالية لمضاد Pipracillin (PRL) ولمضادAugmantine (AMC) بنسبة100% وكذلك مقاومة عالية لكل من(Cefotaxim وCeftazidum )وبناءا على ذلك فان22 عزلة غير قادرة على انتاج ESBLs.

اما عن AmpC فأن النتيجة الموجبة كانت بنسبة 27%من مجموع عزلات الراكدة البومانية من خلال المقاومة لمضادCefoxitin بعد مدة حضن اربعة ايام بدرجة 28 درجة مئوية .

كما تم الكشف عن عوامل الضراوة لبكتريا الراكدة البومانية A.bumannii من خلال الكشف عن انزيم البروتييزوجميع العزلات اظهرت النتيجة السالبة لانتاج البروتتيز اذ لم توجد منطقة متحللة حول الزرع والتي تظهر عند النتيجة الموجبة .

وعامل الضراوة الثاني هو تكوين الغشاء الحيوي حيث تم الكشف عنه مظهريا بطريقة الصفيحة المعيارية الدقيقة(MTP)وبعد مجموعة من الخطوات بضمنها التصبيغ بصبغة (Cristal violet)ويتم قراءة الامتصاصية على طول موجي مقداره630 نانومتر بجهاز ELISA reader ومن خلال استخراج قيمة OD من حفر الضبط ((control حيث كان ODC=0>068 ثم نقارنه مع جميع قيم OD لجميع العزلات وبناءا عليه قسمت العزلات الى قوية ومتوسطة لالتصاق أو تكوين الغشاء الحيوي ،قوية بنسبة 31.8%ومتوسطة بنسبة 68.2% ولم توجد عزلات غير مكونة للغشاء الحيوي .

أما عن الكشف الجزيئي لانتاج الغشاء الحيوي فقد تم من خلال الكشف عن جينات(bap وcsuE )وبنسب (77.3%و72.7%) على التواليي.

وفقا لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لجينERIC الذي تم لجميع عزلات الراكدة البومانية وجدت شجرة النشوء والتطور ل22عزلة والتي صنفت عزلات الراكدة البومانية في هذه الدراسة الى ستة مجاميع المجموعة (A)هي مجموعة عنقودية تتألف من 12 سلالة(7،9،10،17،5،8،6،11،12،2,4و19 )معزولة من عينات دم ومسحات ،المجموعة (B)هي مجموعة منفردة تتألف من سلالة واحدة متمثلة بسلالة رقم 18 معزولة من الحروق، المجموعة (C)وهي مجموعة منفردة تتألف من سلالة واحدة متمثلة بسلالة رقم (3)معزولة من الحروق ،المجموعة(D)وهي عنقودية تتألف من سلالتين هما (13،1)وكلاها معزولة من عينات دم ،المجموعة (E)وهي عنقودية تتألف من5 سلالات (20،21،22،14و15)المعزول من مصادر مختلفة ،المجموعة (F) وهي مجموعة منفردة تتألف من سلالة واحدة متمثلة بسلالة رقم (16)المعزولة من مسحات الحروق.

أما عن الدراسة الجزيئية لل RNA من الراكدة البومانية A.bumannii حيث كان هدفها عزلتين هما العزلة الخامسة والعزلة العاشرة ذواتا اعلى قراءة في تكوين الغشاء الحيوي وفقا لطريقة الصفيحة المعيارية الدقيقة حيث العزلة الخامسة معزولة من الجروح والعزلة العاشرة من الدم وتم قياس التعبير الجيني لجينات (bapوcsuE )المسؤولة عن تكوين الغشاء الحيوي قبل وبعد المعاملة بمضاد Colistin والذي يعمل على الغشاء الحيوي ويمنع تكوينه، تمت التجربة بألاعتماد على ما بعد التركيز المثبط الادنى Sub MICمن Colistin حيث كان للعزلة الخامسة 16 وللعزلة العاشرة 8.كما تم معاملة نفس العزلات بالحديد بتراكز(20-50)مايكرو كرام على مايكرولتر بأستعمال FeCl3في وسطM9.

بأستخدام طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل بالزمن الحقيقي qRT-PCR بتقنية (Syber green)اولا للتعبير الجيني لل bap جين حيث لوحظ ان هناك تغير فيCT الجين قبل وبعد المعاملة بمضاد colistin الذي قاد الى زيادة في التعبير الجين للbap بالاعتماد على معادلة خاصة ، حيث اظهرت العزلات معدل تغير مقداره 2.6 بعد المعاملة لكلا العزلتين. وبتجربة اخرى للايجاد التعبير الجيني لنفس الجين لكن بمعاملة اخرى ،وهي الحديد بتراكيز 20و50 مايكرو كرام على مايكرو لتر واعتبار التركيز 50 كمنظم(control)حيث اظهرت النتائج سلوك مغاير للعزلة الخامسة حيث ادت المعاملة بالحديد بتركيز 20 الى نقصان التعبير الجيني للbap جين. اما عن csuE اظهرت النتائج حدوث تغير في التعبير الجيني قبل وبعد المعاملة بمضاد Colistin وأظهرت كيلا العزلتين زيادة في التعبير الجيني للcsuE .

وتألفت لجنة المناقشة من السادة المدرجة أسماؤهم أدناه:

أ. د. كريم ابراهيم مبارك / جامعة ديالى / كلية العلوم .. رئيساً
أ. د. رنا مجاهد عبد الله / جامعة بغداد / كلية التربية للعلوم الصرفة – ابن الهيثم .. عضواً
أ. م. د. عباس محي مزهر / جامعة ديالى / كلية العلوم .. عضواً
أ. م. د. ازدهار محمد جاسم / جامعة ديالى / كلية العلوم .. عضواً ومشرفاً

وقد تم قبول الرسالة ومنحت الطالبة درجة الماجستير في تخصص علوم الحياة .. ألف مبارك ..