مناقشة رسالة طالبة الماجستير زهراء علي فاضل من قسم علوم الحياة

ناقش قسم علوم الحياة في كلية العلوم بجامعة ديالى رسالة طالبة الماجستير زهراء علي فاضل الموسومة التنميط الجزيئي لبكتريا Staphylococcus aureus المعزولة من عينات سريرية مختلفة وذلك في يوم الأربعاء الموافق 2021/8/4 وعلى قاعة المناقشات في قسم علوم الكيمياء.

أوضحت الباحثة في دراستها أن المكورات العنقودية الذهبية Staphylococcus aureus المقاومة للميثيسيلين من الانواع البكترية المسببة للأمراض الشائعة في كل من المستشفيات والمجتمع. تم استخدام عدة تقنيات لتنميط المكورات العنقودية الذهبية المقاومة للميثيسيلين ( MRSA). تتميز إحدى الطرق بقدرة تمييزية أكبر وقوية وفعالة من حيث التكلفة تسمى تقنية تحليل التكرارات الترادفية للأرقام المتغيرة (VNTRs) باستخدام العديد من الجينات التي تمتلك عددًا مختلفًا التكرارات.

حيث تم الحصول على 40 عزلة (%14.4) من بكتريا المكورات العنقودية الذهبية من (276) عينة سريرية من الاناث. تضمنت ادرار، مسحات مهبلية، وبأعمار مختلفة ، ومستشفيات محلية متنوعة، وقد أعطت (187) عينة نمو إيجابي بينما (89) عينة لم يظهر فيها نمو. تم جمع العينات خلال الفترة الزمنية من أكتوبر / 2020 الى يناير / 2021، من مجموعة المرضى الراقدين والمراجعين في المستشفيات الحكومية المحلية ضمن منطقة الدراسة.

وان التشخيص الاولي لبكتريا المكورات العنقودية الذهبية تم باستخدام الأوساط الزرعية اكار الدم واكار ملح المانيتول، واعتماداً على الاختبارات البيوكيميائية ونظام الفايتك. وقد تم التأكيد النهائي بأستخدام طريقة التشخيص الجزيئي بأستخدام تقنية تفاعل البلمرة المتسلسل بوساطة جين 16S rRNA للكشف عن النوع. كانت نسبة ظهور الجين في العزلات 100%. تم تحديد الحساسية للمضادات الميكروبية لعزلات Staphylococcus aureus بطريقة الانتشار القرصي تجاه 13 مضاد حيوي، وكانت نتائج مقاومة العزلات للمضادات الحيوية كما يأتي: (الاوكساسيلين 92.5%) ، (السيفتازيديم 95%) ، (المثيسيلين 100%) ، (السيفوتاكسيم 37.5%) ، (السيفوكستين 62.5%) ، (الاميبينيم 10%) ، (الفانكومايسين 75%) ، ( الازثرومايسين 87.5%) ، (الاميكاسين 2.5%) ، (الجنتامايسين 37.5%) ، (التتراسايكلين 65%) ، (السيبروفلوكساسين 40%) ، (النورفلوكساسين 40%).

تمايزت الأربعين عزلة من Staphylococcus aureus قيد الدراسة لنمطين حسب مقاومة المضادات الحيوية في اختبار الحساسية ، 29 (72.5%) عزلة كانت متعددة المقاومة (MDR ) Multidrug resistance، قاومت (3 – 7) مجاميع من المضادات الحيوية ضمن الدراسة و 10 (25%) من العزلات Extensive drug resistance (XDR) قاومت (8) مجاميع ، و 1 (2.5%) من العزلات قاومت كل المجاميع التي تم استخدامها في الدراسة.

تم تحديد التركيز المثبط الأدنى Minimum inhibitory concentratio (MIC) لجميع العزلات لمضادين حيويين (Ceftazidime، Vancomycin). وبأستخدام الطريقة المعيارية بوساطة لوحة العيار الدقيقة عن طريق التخفيف التسلسلي لـMuller Hinton Broth. أظهرت النتائج ان قيم MIC لـلـ Ceftazidimeتراوحت بين (8-512) ميكروغرام/ مل وقيمMIC للـ Vancomycinبين (16-128) ميكروغرام/مل.

أظهرت نتائج الكشف عن عوامل الضراوة ان جميع عزلات المكورات العنقودية الذهبية البالغ عددها (40) كانت مكونة للاغشية الحيوية ومنتجة لانزيم الهيمولايسين، ولانزيم اليوريز ، في حين ان 28(70%) منتجة للبروتيز المحلل للبروتين. أوضحت النتائج كذلك بأن 13(32.5%) من هذه العزلات كانت منتجة لانزيمات بيتا لاكتميز واسعة الطيف ESBLs، بينما كانت 36(90%) عزلة منها منتجة لانزيمات بيتا لاكتميز المعدني .MBLs ، وكانت نتائج 9 عزلات (22.5%) منتجة لانزيمات AMP^c.

تم اختيار 10 عزلات من MRSA لاجراء Multiplex PCR وفقاً للمقاومة المتعددة للمضادات الحيوية، تم اختيار خمسة مواقع، clfB (عامل التكتل B)، spa (بروتين المكورات العنقودية A)، sspA (سيرين بروتياز V8)، clfA (عامل التكتل A)، و sdrC (بروتينات ربط الفيبرينوجين الغنية Ser-Asp) لتحليل عزلات البكتريا العنقودية المقاومة للمثيسيلين على أساس عدد متغير متعدد التركيز من التكرارات الترادفية (MLVA). تم استخدام البوادئ المعلمة بالصبغات المتفلورة لاجراء تفاعل متعدد التضاعف في تفاعلين منفصلين من تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) يشمل اولاً على clfB و spa و sspA والثاني على clfA و sdrC. اخضعت نواتج تقنية الـ PCR الى الترحيل الكهربائي الشعيري اعتمادا على ABI genetic analyzer. تم تحليل البيانات التي تم الحصول عليها من الترحيل الكهربائي الشعيري والظاهرة على شكل قمم باستخدام برنامج Applied Biosystem GeneMapper ™ Software 5 للحصول على الحجم الجزيئي لنواتج الـ PCR الدقيق. واظهرت النتائج للمورث clfB وجود 5 أنواع مختلفة من القطع المضخمة في 10عزلات من MRSA بعد تحليل مسح المورثات ، و 3 أنواع مختلفة من القطع المضخمة من المورث spa ،اما المورث sspAظهرت 5 أنواع مختلفة من القطع المضخمة ، و 6 أنواع مختلفة من القطع المضخمة مع المورث clfA ، واخيراً في حالة المورث sdrC هناك3 انواع من القطع المضخمة. تم استخدام بيانات التسلسل للسلالة القياسيةNCTC8325 Staphylococcus aureusفي حسابTandem Repeats Finder وهو برنامج في المعلوماتية الحيوية لحساب احجام القطع لكل موقع في جميع العزلات وتحويله إلى عدد مكرر. حدد البرنامج عدد التكرارات الموجودة في تسلسل الحمض النووي لخمسة مواقع. تم استخدام عدد التكرارات التي تم الحصول عليها لخمسة مواضع لإنشاء نسق أليلي . تم اخضاع التكرارات التي تم الحصول عليها باستخدام خمسة مواضع لكل عزلة في برنامج Bionumeric. صنفت جميع عزلات MRSA البالغ عددها 10 الى 10 أنماط جينية وكانت نسبة التشابه بين التكرارات في خمسة مواضع 100 ٪ بدون اعتماد ال cut off وبااستخدام minimum spanning tree ، ووفقًا للنتائج وجد أن معظم الأنماط الجينية تنشأ من النمط الجيني 9 ممثلة بالعزلة رقم 9 ، كما تم استخدام النسق الأليلي لرسم مخطط الشجرة واظهرت جميع عزلات MRSA العشرة والتي تم تصتيفها في 10 نمطًا وراثيًا بنسبة تشابه 100٪ ( cut off). ولكن عندما تم تطبيق 50 ٪ من cut off تم تجميع 10 نمطًا وراثيًا في 5 مجاميع. أدى استخدام MLVA إلى تكتل سريع وموثوق لعزلات MRSA المتفشية. نظرًا لأن أرقام التكرار المختلفة في مواقع مختلفة كانت تعتبر دليلاً على أن VNTR كانت عرضة للانتقاء الطبيعي مما تسبب في تباينات عالية، فقد توفر كتابة MLVA أيضًا معلومات حول العمليات التطورية.